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三七总皂苷干预去势骨质疏松性骨折模型大鼠的(2)
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摘要：1.4.5 指标监测 连续干预10周后取各组大鼠尾部静脉血2 mL，2 000 r/min离心15 min，分离上清液，于-80 ℃保存。使用酶联免疫吸附实验法检测谷胱甘肽过氧化物
1.4.5 指标监测 连续干预10周后取各组大鼠尾部静脉血2 mL，2 000 r/min离心15 min，分离上清液，于-80 ℃保存。使用酶联免疫吸附实验法检测谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化脂、丙二醛水平：取50 mm碳酸盐包缓冲液对抗原进行稀释，将其加入聚苯乙烯的反应孔中，加盖处理后，在温度4 ℃的条件下放置24 h，次日洗涤3次后，抛干，在每孔中均加入稀释液稀释的待测标本0.1 mL，并加入阳性和阴性对照标本，在温度为42 ℃的条件下放置60 min，将液体移除并洗涤3次后，抛干，在每孔中加入谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化脂、丙二醛抗体0.1 mL，再次放置60 min，将液体移除并洗涤3次，抛干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4，0.05 mol/L的枸橼酸)混匀，且加入0.1 mL邻苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L mL放置各孔内，终止反应。使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，分析谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化脂、丙二醛水平。
免疫透射比浊法检测骨钙素、Ⅰ型前胶原羧基端前肽、骨特异性碱性磷酸酶水平[7]：准备3个试管并分别标记为标准管、测定管及空白管，3个试管中均加入350 μL缓冲液，标准管中加入20 μL 骨钙素、Ⅰ型前胶原羧基端前肽、骨特异性碱性磷酸酶标准液，测定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸馏水3个试管分别摇晃均匀，常温环境静置5-10 min后使用分光光度计进行比色，在500 nm波长处以空白管调零，记录吸光度，对骨钙素、Ⅰ型前胶原羧基端前肽、骨特异性碱性磷酸酶水平进行计算。
化学发光法检测骨形成发生蛋白2、血管内皮生长因子水平，检测过程严格按照酶联免疫吸附试剂盒说明书进行[8]。
Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR表达[9]：使用PBS对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%的牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对PI3K、Akt和mTOR表达进行检测。
1.5 主要观察指标 骨密度、骨体积分数、骨痂骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度以及骨细胞指数。
1.6 统计学分析 使用SPSS 21.0软件(美国IBM公司)处理。计量资料使用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜ 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 正常组含10只大鼠，其余40只大鼠建立去势骨质疏松性骨折模型，建模失败3只，成功37只。
2.2 去势骨质疏松性骨折模型的鉴定 连续干预10周后，以X射线检测可见模型组大鼠骨折线仍较为清晰；三七总皂苷低剂量组大鼠骨折线仍清晰，但形成少量骨痂；三七总皂苷中剂量组大鼠骨折线稍模糊，形成大量骨痂；三七总皂苷高剂量组大鼠骨折线模糊，形成大量骨痂，见图1。
2.3 三七总皂苷对去势骨质疏松性骨折模型大鼠骨密度和骨细胞指数的影响 如表1所示，模型组大鼠骨密度和骨细胞指数均低于正常组(P＜ 0.05)；三七总皂苷低、中、高剂量组大鼠骨密度和骨细胞指数均高于模型组(P＜ 0.05)，但仍低于正常组(P＜ 0.05)；且三七总皂苷高剂量组大鼠骨密度和骨细胞指数均高于三七总皂苷低、中剂量组(P＜ 0.05)。
2.4 三七总皂苷对去势骨质疏松性骨折模型大鼠骨体积分数和骨小梁参数的影响 如表2所示，三七总皂苷低、中、高剂量组大鼠骨体积分数、骨痂骨小梁数量、骨小梁厚度均高于模型组(P＜ 0.05)，但骨小梁分离度低于模型组(P＜ 0.05)；且三七总皂苷高剂量组大鼠骨体积分数、骨痂骨小梁数量、骨小梁厚度均高于三七总皂苷低、中剂量组(P＜ 0.05)，而骨小梁分离度低于低、中剂量组(P＜ 0.05)。
图1｜去势骨质疏松性骨折模型的X射线图像Figure 1｜X-ray images of ovariectomized osteoporotic fracture model图注：图中A为模型组，骨折线清晰；B为三七总皂苷低剂量组，骨折线清晰，但出现少量骨痂；C，D分别为三七总皂苷中、高剂量组，骨折线稍模糊，存在大量骨痂
表1｜三七总皂苷对去势骨质疏松性骨折模型大鼠骨密度和骨细胞指数的影响 (±s)Table 1 ｜Effects of Panax Notoginsenosides on bone mineral density and bone cell index in ovariectomized osteoporotic fracture rats表注：与正常组相比，aP＜ 0.05；与模型组相比，bP＜ 0.05；与三七总皂苷低剂量组相比，cP＜ 0.05；与三七总皂苷中剂量组相比，dP＜ 0.05?
表2｜三七总皂苷对去势骨质疏松性骨折模型大鼠骨体积分数和骨小梁参数的影响 (±s)Table 2 ｜Effects of Panax Notoginsenosides on bone volume fraction and trabecular parameters in ovariectomized osteoporotic fracture rats表注：与正常组相比，aP＜ 0.05；与模型组相比，bP＜ 0.05；与三七总皂苷低剂量组相比，cP＜ 0.05；与三七总皂苷中剂量组相比，dP＜ 0.05?
文章来源：《动物医学进展》 网址: http://www.dwyxjzzz.cn/qikandaodu/2021/0804/501.html